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Electroporation克隆 (電擊) 感受態(tài)細胞

簡要描述:DB3.1 Electroporation-Competent Cell/ Electroporation克隆 (電擊) 感受態(tài)細胞
保存條件:-80℃

  • 產(chǎn)品型號:DB3.1
  • 產(chǎn)品品牌:Abnbio
  • 更新時間:2024-03-25
  • 訪  問  量:257

詳細介紹

品牌Abnbio貨號ABD304-20
規(guī)格20支50ul供貨周期現(xiàn)貨
主要用途細胞培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥

DB3.1 Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態(tài)細胞

基因型:

F- gyrA462 endA1 glnV44 (sr1-recA)mcrBmrr hsdS20(rB-,mB-)ara14galK2lacY1proA2rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1

簡要說明:

DB3.1大腸桿菌菌株基因組中含有g(shù)yrA462基因,賦予其對ccdB毒性基因的抗性,特別適用于構(gòu)建或擴繁含有ccdB基因的質(zhì)粒載體(例GATEWAY System vector) ,此菌株具有連、霉素抗性。  High5TM系列DB3.1電擊感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,經(jīng)pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率>1010 cfu/μg DNA。

操作說明:

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘,待其瀝干水分,正置 5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置 5分鐘充分降溫。

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的 DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質(zhì)粒 pUC19;  B. 對于連接產(chǎn)物,請用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸,DNA 濃度不超過100ng/μl,體積不超過 5μl/50μl 感受態(tài)。

三、用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。

四、啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8kV(此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入 700 μl不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。37℃,225rpm 復(fù)蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取 100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C 平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑 15cm培養(yǎng)皿2-5 個)。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17 小時。

注意事項:

(一)加入DNA 時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

(二)電擊感受態(tài)細胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。

(三)當(dāng)DNA 不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

(四)電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。

(五)若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

(六)對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化, 最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產(chǎn)物,保證DNA 濃度不超過 100ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率,增加弧光放電的風(fēng)險。

(七)混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

(八)電擊感受態(tài)細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。



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