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Electroporation克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞

簡要描述:TOP-10 Electroporation-Competent Cell/ Electroporation克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞
保存條件:-80℃

  • 產(chǎn)品型號:TOP-10
  • 產(chǎn)品品牌:Abnbio
  • 更新時間:2024-03-25
  • 訪  問  量:217

詳細(xì)介紹

品牌Abnbio貨號ABD301-20
規(guī)格20支50ul供貨周期現(xiàn)貨
主要用途細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥

TOP-10 Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞

基因型:

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galKrpsL (Strr)endA1nupG

簡要說明:

TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化,不能用于熱激轉(zhuǎn)化。 TOP-10來源于MC1061菌株, 是目前實驗室常用的感受態(tài)細(xì)胞之一,基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型,而 TOP-10為galU 型)。 TOP-10 生長速度快 (比DH5α快,但比 Mach1-T1生長速度慢), 10小時可見克隆。 recA1和endA1 的突變有利于插入 DNA 的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA 的提取??捎糜跇?gòu)建克隆,藍(lán)白斑篩選等實驗,具有l(wèi)ian霉素抗性。TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×1010 cfu/μg DNA。

操作說明:

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘,待其瀝干水分,正置 5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置 5分鐘充分降溫。 

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的 DNA (質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質(zhì)粒 pUC19;  B. 對于連接產(chǎn)物,請用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸,DNA 濃度不超過100ng/μl,體積不超過 5μl/50μl 感受態(tài)。 

 三、用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。 

四、啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8kV(此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。  

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入 700 μl不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。37℃,225rpm 復(fù)蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取 100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C 平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑 15cm培養(yǎng)皿2-5 個)。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17 小時。

注意事項:

(一)加入DNA 時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

(二)電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。

(三)當(dāng)DNA 不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

(四)電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細(xì)胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。 

(五)若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

(六)對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化, 最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產(chǎn)物,保證DNA 濃度不超過 100ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率,增加弧光放電的風(fēng)險。

(七)混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細(xì)胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

(八)電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。

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