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Chemically 酵母感受態(tài)細(xì)胞

簡要描述:Y1HGold Chemically Competent Cell/Chemically 酵母感受態(tài)細(xì)胞
保存條件:-80℃

  • 產(chǎn)品型號:Y1HGold
  • 產(chǎn)品品牌:Abnbio
  • 更新時間:2024-03-27
  • 訪  問  量:358

詳細(xì)介紹

品牌Abnbio貨號ABG700-50
規(guī)格50支100ul供貨周期現(xiàn)貨
主要用途細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥

Y1HGold Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型:

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3,112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1

簡要說明:

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)用菌株,MATα型,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行篩庫試驗。Transformation marker為:ura3,leu2;報告基因為:AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用:pAbAi 和PGADT7。質(zhì)粒pAbAi的篩選標(biāo)志為URA,用于表達(dá)pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列重復(fù)串聯(lián)后克隆到pAbAi中);質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為LEU,用于表達(dá)AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。此外AbAr與營養(yǎng)缺陷報告基因相比具有更低背景的優(yōu)點,可降低酵母單雜假陽性發(fā)生的概率。Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA

操作說明:

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg,BstBI或 BbsI酶切1h,回收; 

2. 取一支無菌的1.5ml EP管,依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg(體積不高于15 µl),Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴,重復(fù)一次)10µl,100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞,PEG/LiAc 500µl,輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次; 

3. 30℃水浴30min,每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次; 

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜(用以提高轉(zhuǎn)化效率,可不做); 

5. 42℃水浴15min,每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次; 

6. 12000rpm瞬時離心棄上清,每支加入1ml的YPD Plus(YPDA)于30℃復(fù)蘇1h(用以提高轉(zhuǎn)化效率,可不做); 

7. 12000rpm瞬時離心棄上清,用100µl 0.9% NaCl重懸,涂板,30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項:

1.PEG在低溫下易析出,請在常溫下wan全溶解后使用。 

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

 3.同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。 

4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。 

5.菌落變粉不是污染,是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,Y1HGold的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole(AIR)在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。 

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆;涂SD單缺平板29℃,48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。



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