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Electroporation根癌(電擊)感受態(tài)細(xì)胞

簡要描述:EHA101 Electroporation-Competent Cell/ Electroporation根癌(電擊)感受態(tài)細(xì)胞
保存條件:-80℃

  • 產(chǎn)品型號:EHA101
  • 產(chǎn)品品牌:Abnbio
  • 更新時間:2024-03-27
  • 訪  問  量:302

詳細(xì)介紹

品牌Abnbio貨號ABN607-50
規(guī)格50支50ul供貨周期現(xiàn)貨
主要用途細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥

EHA101  Electroporation-Competent Cell   根癌(電擊)感受態(tài)細(xì)胞

基因型:

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR)Nopaline

簡要說明:

EHA101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——li福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:kan,賦予EHA101菌株ka那霉素抗性,適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (zhuang觀霉素抗性,size:11876 bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA。

操作說明:

1.0.2cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入1-5ug質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒體積不大于6ul,最好用試劑盒抽提,雙蒸水溶解),用手bo打管底混勻,立即插入冰中,用200ul槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?;旌衔锟焖僖频诫姄舯?,蓋上杯蓋,空管保留待用。

3.啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25uF,PC=200ohm,V=2400V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700ul 無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4.6000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天(當(dāng)平板只含有50ug/ml kan 時,28℃培養(yǎng)48h即可;平板中同時加入50ug/ml kan,20ug/ml rif 時,需28℃培養(yǎng)60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h)。

注意事項:

1.加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10 ;質(zhì)粒不純或存在鹽,乙醇等污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2.混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.li福平濃度不應(yīng)高于25ug/ul,過高的li福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50ug/ml kan,若所用平板含有20ug/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入li福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入lian霉素或qing大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但lian霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮lian霉素或請大霉素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。







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